消可寧對葡萄糖誘導血管內皮細胞誘生型一氧化氮合酶表達變化的抑制作用      【摘要】 目的 探討消可寧對葡萄糖（GS）誘導血管內皮細胞誘生型一氧化氮合酶（iNOS）表達變化的影響。方法  培養人臍靜脈內皮細胞株ECV304細胞，用30 mol/L GS處理3h，用生理鹽水、10－７ mol/L CCK8和0１ mg/L GS+10－６、10－７、１０－８  mol/L CCK8處理16 h；用比色法檢測培養液中一氧化氮(NO)含量、細胞NOS活性，免疫細胞化學及蛋白質免疫印跡法檢測iNOS蛋白表達。結果  與生理鹽水處理的對照組比較，GS誘導培養液NO含量增多、細胞NOS活性增高、iNOS蛋白表達上調；CCK8劑量依賴性抑制GS的上述效應，而單獨作用對iNOS蛋白表達、NOS活性和NO含量均無明顯影響。結論  CCK8可以明顯抑制GS引起ECV304細胞iNOS蛋白表達上調，減少NO生成。
      【關鍵詞】 消可寧；葡萄糖；一氧化氮合酶；血管內皮細胞
Inhibitory effect of cholecystokinin octapeptide on lipopolysaccharideelicited inducible nitric oxide synthase expression in vascular endothelial cells Department of Forensic Medicine and Pathophysiology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, Hebei, China (YAN Jun works at Department of Pathophysiology, Nankai Hospital, Tianjin 300100, China)Corresponding author: GU Zhenyong (Email: zhenyong88@sohu.com)
      【Abstract】 Objective  To investigate the effect of cholecystokinin octapeptide  on lipopolysaccharide (GS)elicited inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression in vascular endothelial cells. Methods Human umbilical vein endothelial cell line (ECV304 cells) was stimulated with vehicle (normal saline) or GS in the presence (001, 01, 1 mg/L) or absence (01 mg/L) of CCK8 (10－6－10－8 mol/L). Nitric oxide (NO) level and cellular nitric oxide synthase (NOS) activity were determined with spectrophotometrically. The iNOS expression was detected with immunocytochemical technique and Western blot. Results  Compared with normal saline, GS significantly induced the upregulation of iNOS protein expression in the cultured ECV304 cells, and NOS activity in ECV304 cells and NO level in cultured media were increased. CCK8 obviously inhibited abovementioned effect of GS in a dosedependent manner. Whereas CCK8 alone did not showed effect on iNOS protein expression, NO level and cellular NOS activity as compared with those values when vehicle was used. Conclusion  CCK8 inhibite GSelicited iNOS expression and NO production in ECV304 cells.
      【Key words】 cholecystokinin octapeptide;lipopolysaccharide；nitric oxide synthase;vascular endothelial cell
        研究發現，血管內皮細胞不僅構成血管的機械性保護屏障，還可合成多種血管活性物質如一氧化氮（NO），調節血管的張力和反應性變化〔１〕。已經證實，NO是內皮衍生舒血管因子（EDRF）的主要化學物質，一氧化氮合酶（NOS）是NO生成的限速酶。在生理條件下，內皮細胞主要存在內皮型一氧化氮合酶（eNOS），NO生成量較少，主要發揮調節血管張力、防止血小板黏附等生理功能；而當內毒素葡萄糖(GS)及促炎細胞因子等刺激血管內皮細胞時，可誘導血管內皮細胞誘生型一氧化氮合酶(iNOS)表達上調，NO生成量明顯增多。過量生成的NO及其衍生物過氧亞硝基陰離子均具有細胞毒效應，可導致細胞損傷。在內毒素休克發病過程中，血管內皮細胞NO的生成、釋放及其生物學效應異常是血管內皮細胞損傷和內皮功能異常的關鍵環節〔2，3〕。保護血管內皮已經成為治療休克的重要途徑。消可寧是一種分布廣泛的神經調節肽，具有抗休克、緩解內毒素休克血管動力學紊亂和細胞保護作用〔3〕。我們以往研究發現，CCK8對內毒素休克時肺循環和體循環血管或內毒素處理離體血管的張力和反應性變化具有明顯的調節作用，可改善NO介導的血管內皮依賴性舒張反應降低〔4〕，抑制GS誘導的肺動脈內皮細胞凋亡，減少NO衍生的強效氧化劑和硝基化因子過氧亞硝基陰離子的生成〔5〕，提示CCK8的作用可能與其改變血管內皮細胞的NO生成、釋放或生物學效應有關。迄今為止，CCK8對血管內皮細胞NO生成變化及NOS的影響尚未見報道。本實驗中在細胞水平觀察CCK8對GS誘導人臍靜脈內皮細胞株ECV304細胞iNOS變化的調節作用，探討CCK8緩解內毒素休克血管動力學紊亂、減輕血管內皮依賴性舒張反應降低的分子機制。
1  材料與方法
1.1  藥品及試劑:CCK8和GS為Sigma產品；細胞培養液RPMI1640為GIBCOBRL產品；NO和NOS試劑盒為南京建成生物公司產品；兔抗人iNOS多克隆抗體(一抗)為美GSanta Cruz公司生產；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG(二抗)為美GVector公司生產；免疫組化試劑盒和3，3′二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒均為北京中山生物公司生產；其他試劑均為G產分析純。
1.2  細胞培養及預處理：人臍靜脈內皮細胞株ECV304細胞購自武漢大學動植物特殊菌種保藏中心。細復蘇之后，用RPMI1640完全培養液(含體積分數為10%的胎牛血清、100 kU/L青霉素、100 kU/L鏈霉素)將細胞數調為1×109/L，接種于25 ml培養瓶中，在37 ℃、體積分數為5%的CO２和95%的O２條件下培養，3 d傳代1次。細胞傳代后36~48 h，當細胞長**培養瓶的80%~90%時開始給予刺激因素。細胞分為4組：①溶劑對照組(對照組)：培養液中加入生理鹽水；②GS組：培養液中加入終濃度分別為001、01和1 mg/L的GS；③CCK8組：培養液中加入終濃度為10－7 mol/L的CCK8；④GS+CCK8組：在培養液中同時加入終濃度分別為10－6、10－7和10－8 mol/L的CCK8和01 mg/L的GS。GS組動態觀察2～24 h，其余各組觀察16 h，每個時間點4個復孔。#p#分頁標題#e#
1.3  細胞培養上清的收集及細胞勻漿制備：將細胞培養液以８５０×g離心3 min，收集上清于試管中，置于70 ℃超低溫冰箱中凍存備用；收集細胞，以細胞裂解液〔0.1 mmol/L TrisHCl緩沖液，pH 7.4，0.1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),0.5 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)，0.1 mmol/L乙二醇四乙酸酯(EGTA),1 μmol/L抑胃肽A，1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)，2 μmol/L 亮抑胃蛋白酶肽〕裂解細胞，冰浴中超聲破碎細胞，于4 ℃、20 000×g離心60 min，上清為細胞勻漿，細胞勻漿蛋白含量用考馬斯亮藍法檢測。

1.4  觀察指標
1.4.1  細胞NOS活性及上清NO含量檢測：采用試劑盒檢測，操作按說明書進行。NOS活性以每克蛋白中NOS活性(kU/g)表示，NO含量以NO的代謝產物NO－２／ＮＯ－３表示。
1.4.2  免疫細胞化學檢測iNOS蛋白表達：按照免疫組化試劑盒說明書操作。ECV304細胞于蓋玻片上貼壁生長，加入前述藥物處理細胞。用體積分數為95％的乙醇固定30 min，體積分數為3％的過氧化氫(H２O２)室溫孵育細胞爬片10 min，以消除內源性過氧化物酶活性。蒸餾水沖洗，001 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 74)洗5 min。正常血清工作液孵育細胞爬片15 min，以減少非特異性染色，然后傾去液體、勿洗。滴加用001 mol/L PBS(pH 74)1∶100稀釋的一抗，4 ℃過夜。0.01 mol/L PBS(pH 74)洗3次，每次3 min。滴加生物素標記的二抗，37 ℃孵育15 min，0.01 mol/L PBS(pH 7.4)洗3次，每次3 min。滴加HRP標記的鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育15 min。0.01 mol/L PBS (pH 7.4) 洗3次，每次3 min。DAB顯色5 min，達到要求顏色深度時，以蒸餾水/自來水終止顯色，中性樹膠封片。陰性對照用PBS代替一抗，其余步驟同上。iNOS免疫細胞化學陽性染色呈棕黃色或黃色。
1.4.3  蛋白質免疫印跡法檢測iNOS蛋白表達：參照文獻〔６〕方法。細胞勻漿蛋白100 μg與等體積上樣緩沖液混勻，沸水加熱5~10 min使蛋白變性，冷卻后用微量加樣器上樣于凝膠加樣孔底部。凝膠所加電壓為8 V/cm，當染料前沿進入分離膠后，電壓提高到15 V/cm，繼續電泳直**溴酚藍到達分離膠底部（約需4 h）。凝膠切角以標注凝膠的方位，置于轉移緩沖液平衡。用去離子水和轉移緩沖液浸泡硝酸纖維素膜和濾紙。在轉移盤上逐層放置3張濾紙、硝酸纖維素膜、凝膠和3張濾紙，確保各層對齊并不留氣泡，將其放入轉移盤中，凝膠側為負極，膜側為正極，電轉移15~2０ h。凝膠染色以檢查蛋白轉移效果。濾膜用麗春紅S染色5~10 min，顯現蛋白帶，切去蛋白Marker區帶以及包含目的蛋白的濾膜，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，其間換水數次，置于含有質量分數為5％的脫脂奶粉封閉液中，平緩搖動1~2 h，0.05 mol/L PBS（pH 76）漂洗，1∶100稀釋的一抗加于濾膜蛋白面上，4 ℃封閉孵育過夜。一抗孵育完畢后，用0.01 mol/L PBS(pH 74)漂洗濾膜3次，每次3 min，其間置于搖床上平緩搖動。將濾膜轉移**另一個封接雜交袋中，加入1∶1 000稀釋的二抗，封閉后將濾膜平放在搖床上平緩搖動，37 ℃孵育1 h。二抗孵育完畢后，用001 mol/L PBS(pH 74)漂洗濾膜4次，前3次每次用時10 min，**后一次用時5 min，其間置于搖床上平緩搖動。將漂洗完畢的濾膜置于DAB工作液中浸泡顯色5~10 min，當蛋白帶的顏色深度達到要求時，以蒸餾水漂洗，終止反應。用數碼照相機拍攝濾膜照片，記錄實驗結果。
1.5  統計學分析：數據用均數±標準差(x±s)表示，采用SPSS 11.5軟件進行方差分析和兩兩比較，Ｐ<0.05為差異有統計學意義。
2  結果
2.1  GS對ECV304細胞NO含量、NOS活性及iNOS蛋白表達的影響(圖1~5，彩色插頁圖6)：1 mg/L GS處理細胞2、4、8、16和24 h，細胞培養液上清中NO含量明顯升高，NOS活性亦明顯增強；0.01～1 mg/L GS處理ECV304細胞16 h，細胞培養液上清中NO含量明顯升高，NOS活性亦明顯增強，各濃度GS處 理ECV304細胞的NO含量和NOS活性與對照組比較差異均有顯著性（Ｐ<0.05或Ｐ<０.０１）。對照iNOS蛋白幾乎沒有表達或表達量極少；0.1 mg/L GS處理細胞16 h，iNOS表達明顯上調，主要分布于細胞漿。
2.2  CCK8對ECV304細胞NO含量、NOS活性及iNOS蛋白表達的影響(圖5，彩色插頁圖6，圖7，圖8)：10－7 mol/L CCK8處理細胞16 h，NO含量、NOS活性無明顯變化，與對照組比較差異均無顯著性（Ｐ均>0.05）。與對照組比較，10－7 mol/L CCK8處理細胞16 h iNOS蛋白表達略微上調，細胞定位沒有變化。
2.3CCK8和GS對ECV304細胞NO含量、NOS活性及iNOS蛋白表達的影響(圖5，彩色插頁圖6，圖7，圖8)：10－6、10－7和10－8 mol/L CCK8與0.1 mg/L GS共同處理細胞16 h，NO含量降低，與0.1 mg/L GS處理時比較差異均有顯著性（Ｐ均<001），而與對照組比較差異則均無顯著性（Ｐ均>0.05）；NOS活性與０.１ mg/L GS處理時比較均明顯降低（Ｐ均<0.01），與對照組比較均明顯增高（Ｐ均<001）；iNOS蛋白表達比GS組明顯降低，但高于對照組。
3  討論
        本實驗中以人臍靜脈內皮細胞株ECV304細胞為靶細胞，**在培養的血管內皮細胞中觀察了CCK8對GS誘導ECV304細胞iNOS表達、NOS活性及NO生成變化的影響。結果1 mg/L GS作用2~24 h，內皮細胞NO生成量明顯增多，總NOS活性明顯增強，均呈現時間依賴性。在作用16 h時間點，當GS濃度逐漸增加時，ECV304細胞NO生成量顯著增加、NOS活性明顯增強，具有濃度依賴性效應。同時，血管內皮細胞iNOS蛋白表達明顯上調，表明iNOS大量誘生是本階段NO生成增多的主要因素。#p#分頁標題#e#
單純加入CCK8 作用于靜息ECV304細胞時，NO生成量和NOS活性與對照組比較無明顯變化，說明CCK8本身對靜息狀態下的ECV304細胞NO生成可能沒有明顯影響。CCK8與GS同時作用于ECV304細胞16 h后，血管內皮細胞NO生成量與單純GS作用時比較明顯減少，與對照組比較沒有明顯變化；而NOS活性明顯降低，與對照組比較卻明顯增加；同時，iNOS蛋白表達明顯減少。結果提示，CCK8可抑制GS長時間刺激血管內皮細胞誘導的iNOS蛋白表達上調，這可能是NOS活性降低、NO生成減少的重要原因。研究證實，在iNOS基因上游的調控區有核轉錄因子κB（NFκB）結合域〔7〕，GS通過誘導NFκB活化、向核內移位，引起iNOS基因表達上調〔8〕。NFκB為有多向性轉錄調節的蛋白因子，能與多種炎癥介質基因啟動子部位κB位點發生特異性結合，并增強基因轉錄〔９，１０〕。我們以往的研究發現，CCK8可抑制GS誘導ECV304細胞NFκB表達上調，抑制內毒素血癥肺組織NFκB活化與向核內移位〔11〕，這可能是CCK8抑制GS誘導ECV304細胞iNOS蛋白表達上調及NO生成增多的重要分子機制。應當注意，CCK8對GS誘導血管內皮細胞NOS活性增強呈部分抑制作用，而且抑制程度不如對NO生成的抑制效應明顯，提示CCK8對GS誘導血管內皮細胞NO生成的調節作用可能還有其他途徑，如CCK8可能對細胞精氨酸酶和超氧化物歧化酶（SOD）活性有調節作用，可以改善NOS底物代謝或者NO的生物學效應。以往研究發現，CCK8降低內毒素休克血管壁NOS活性、減少NO生成量，這與本研究中CCK8抑制GS誘導血管內皮細胞iNOS蛋白表達上調一致。
       綜上所述，CCK8可明顯抑制GS引起血管內皮細胞iNOS蛋白表達上調、減少NO生成，這可能是CCK8減少NO衍生強效氧化劑和硝基化因子如過氧亞硝基陰離子的生成〔4〕，發揮CCK8保護作用、抑制血管內皮細胞凋亡的機制之一。